¿Qué es la parabiosis?

Según el contexto, la parabiosis puede hacer referencia a diferentes cosas. Etimológicamente, proviene del griego «para» («al lado, fuera de») y «biosis» (vida). Vendría a ser algo así como «vida al lado de», o «vida fuera de». Un ejemplo de parabiosis en la naturaleza es, por ejemplo, los siameses.

Hace algunos años comenté un artículo en el que utilizaban esta técnica y mostraban una mejora en el deterioro cognitivo asociado a la edad y la plasticidad sináptica. En esta ocasión, voy a entrar en detalle en el procedimiento.

En el terreno que nos interesa, la parabiosis se refiere a un procedimiento por el cual se busca la unión de dos organismos (generalmente a través del sistema vascular) de modo que la vida o función de ambos pueda proseguir tras la intervención. Utilizo función intencionadamente, con la imagen del ser de dos cabezas y un cuerpo.

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Un cuerpo. Dos cabezas. No creerás lo que sucedió después

Bromas (y no tan bromas) a parte, la parabiosis no es nada nuevo. Los primeros estudios experimentales se realizon a finales del s. XIX 1 y desde principios del siglo pasado se realiza de forma recurrente. Con la experiencia se observó que el éxito del procedimiento era mayor cuanto más parecidos eran los sujetos (edad, sexo, compañeros de jaula…). Sin embargo, no se pueden poner vallas al campo, y los investigadores empezaron a preguntarse qué pasaría al exponer el entorno de un sujeto al de otro, totalmente distinto. La exploración de esta idea en el campo de la obesidad dio como resultado uno de los descubrimientos más importantes, en mi opinión, derivados del uso de esta técnica: la leptina. Aunque la hormona no se identificó hasta años después, fueron varios experimentos con parabiosis entre ratones obesos y no obesos lo que movió este hallazgo.

La popularidad de la técnica cayó en las décadas posteriores, aunque en los últimos años parece que vuelve a estar de moda. Especialmente en el campo del envejecimiento. De manera similar a lo que Coleman, Friedman y amigos 2,3 realizaron con ratones obesos y no obesos, a principios de la década pasada Weissman, Wagers y Rando, un trío calavera de la Universidad de Stanford, observaron una regeneración de tejidos en ratones viejos a partir de células madre provenientes de ratones jóvenes 4,5,6.

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Número de estudios con parabiosis, por década (Fuente: PubMed)

Los estudios de heterocronicidad comenzaron a mostrar cómo factores derivados del entorno fisiológico de ratones jóvenes eran capaces de activar rutas moleculares en células madre hepáticas, musculares, etc., de parabiontes viejos y provocar regeneración de tejidos y proliferación de estas células madre. Esto fue tremendo, ya que hasta entonces la visión general era que el envejecimiento y el daño tisular asociado a la edad eran causados por un daño intrínseco en la célula. Los experimentos con parabiosis retaron esta idea y propusieron que los cambios y deterioros asociados al envejecimiento están influidos significativamente por el entorno molecular que rodea y baña al tejido.

Más allá del avance sobre órganos periféricos, la parabiosis ha servido para descubrir algunos aspectos muy interesantes del sistema nervioso central. En el estudio que refería al principio, Villeda y colaboradores lograron una reducción del deterioro cognitivo asociado a la edad, un incremento en la densidad dendrítica y una mejora de la plasticidad sináptica en el hipocampo de ratones viejos unidos a otros más jóvenes. En concreto, los resultados de estos estudios otorgan un papel especial a la activación de CREB en esta estructura.

Existen pocos estudios que exploran el comportamiento de la microbiota con esta técnica 7,8. Sin embargo, dada la validez en el estudio del cerebro y la creciente acumulación de datos que invitan a pensar en la existencia de una conexión entre el cerebro y la microflora intestinal, no es descabellada la posibilidad de aplicar este procedimiento en el estudio del eje intestino cerebro. Con total seguridad, es algo que eventualmente sucederá. Cuánto queda para ello es otra cuestión. Aunque algo me dice que no falta mucho.

Para finalizar, quería dejar clara mi opinión sobre una cosa. La parabiosis no es agradable; no es agradable de realizar, observar, ni interactuar con el resultado. Es útil, válida y bajo las condiciones de experimentación adecuadas no es necesariamente más traumática que otros protocolos ampliamente utilizados. No obstante, siempre, como con cualquier otra técnica, pero quizá especialmente en este caso, su uso debe estar unequívocamente justificado.

Eje intestino-cerebro (II)

En la entrada previa traje parte del trabajo de revisión de Hooks et al. acerca de las limitaciones y aspectos metodológicos más controvertidos del estudio del EIC. Los autores diferenciaban dos grandes categorías. La primera, los métodos de estudio más populares, fue el tema de la anterior entrega. La segunda, en la que me centro hoy, concierne la conducta y la estadística. Boy oh boy.

La conducta y las diferencias de perfil hormonal son los temas de interés principal de los veinticinco artículos más citados sobre el EIC. Si se analizan en conjunto, se puede extraer fundamentalmente cinco focos de atención:

  1. Eje neuroendocrino de la respuesta de estrés. Aproximadamente la mitad de los Top 25 exploran la activación del eje neuroendocrino en la respuesta al estrés, la consecuente producción de glucocorticoides y la relación con otras variables biológicas y conductuales 1,2,3.
  2. Afecto-emoción: ansiedad. Aproximadamente la mitad de los Top 25 se centran en la ansiedad como variable de observación 4,5.
  3. Alteraciones del afecto: depresión. Aproximadamente un cuarto se centra en el estudio de la depresión y su relación con el EIC (REFS). Curiosamente, es sobre la relación entre la depresión y el EIC donde la evidencia parece más sólida 6,7.
  4. Trastornos del desarrollo/Espectro autista. Dos artículos del Top 25 investigan la relación entre la microbiota intestinal y el autismo, en modelos animales 8,9.
  5. Cognición. Seis artículos de entre los más citados sobre el EIC estudian algún tipo de cognición 10,11.

Es especialmente importante mencionar que la mayoría de estos Top 25 no aportan justificación suficiente para el uso de una u otra metodología a la hora de poner a prueba sus hipótesis. Ocasionalmente afrontan los potenciales factores de confusión que podrían comprometer la interpretación de los resultados y limitan la generalización de los hallazgos. Y esto parece la norma tanto para las pruebas bioquímicas como conductuales, ya que en pocas ocasiones se discute la idoneidad de los paradigmas utilizados. El argumento más extendido suele ser la referencia a trabajos previos en que se utiliza tal o cual técnica. Lo que en absoluto es garantía de nada. Y en particular cuando se trata de estudios preclínicos. Un ejemplo es la memoria. Existen diferentes tipos de memoria y diferenets paradigmas para estudiarla, siendo unos más eficientes que otros. Así pues, si la hipótesis que se plantea tiene como centro la memoria espacial, es mucho más adecuado (en mi humilde opinión) utilizar un test como el laberinto de Morris que el reconocimiento de objeto, por más común que sea este último.

Sin embargo, quizá el aspecto más importante a tener en cuenta desde el punto de vista metodológico es la translacionalidad. Es decir, la capacidad de extrapolar los resultados obtenidos en modelos animales a humanos. Cuando se estudia la conducta, esto es algo que ha de determinarse y tenerse en cuenta con cuidado. Desafortunadamente, en el campo de estudio del EIC la translacionalidad parece obviarse más de lo que se debería.

Por último, los autores de esta revisión llaman la atención sobre la estadística utilizada para analizar los datos en la mayoría de estos artículos. Las dos pruebas más comunes son el ANOVA de un factor y la prueba t de Student, incluso en diseños en que se introducen más de una variable independiente (en cuyo caso habría que utilizar un ANOVA de dos o tres factores). En el contexto de la investigación biomédica es poco frecuente encontrar resultados que se deban únicamente a un factor o variable. En el estudio del EIC, por ejemplo, cuando se estudia el estrés, ya son como mínimo dos factores que se han de analizar de forma independiente primero (estrés, microbiota), además de su posible interacción después.

A parte, no sólo en este Top 25, sino en otras muchas publicaciones, el uso que se hace de las pruebas estadísticas deja bastante que desear; interacciones que no se siguen de un análisis post hoc, pruebas post hoc sin existir una interacción significativa, pruebas post hoc inadecuadas para el diseño que se ha planteado, falta de correcciones, falta de información sobre el tamaño del efecto… Más aún, algunos artículos utilizan los resultados negativos como un argumento a favor. Por ejemplo, que la falta de resultados significativos tras una intervención sobre la microbiota es un argumento a favor del potencial efecto de la misma 12. Pero este es un tema diferente y que sin duda afecta a más campos que el EIC.

En resumen, los problemas que acucian a la investigación del EIC se pueden agrupar en los siguientes:

  • Afirmaciones sobre causalidad y determinismo.
  • Afirmaciones sobre los beneficios que la evolución de la microbiota ha significado para el el estado del cerebro.
  • Afirmaciones sobre la evolución paralela y simbiótica en el desarrollo y los periodos críticos.
  • Problemas con los probióticos.
  • Problemas con la comunicación de la ciencia.

Para mí no cabe duda de que en los próximos años el estudio del EIC aportará resultados e información con potencial para cambiar totalmente lo que se conoce acerca del comportamiento… Pero también creo que antes de que eso ocurra habrá mucho que trillar. La clave, como en tantas otras ocasiones, es contar con buenos diseños, buenas preguntas y procesos de análisis adecuados para minimizar el riesgo de publicar artículos poco rigurosos.

Pero esto es solo una opinión, vaya.

 

 

Eje intestino-cerebro (I)

En los últimos 10, 15 años se ha presenciado un incremento reseñable en el número de estudios centrados en el eje intestino-cerebro (EIC). Me extrañaría alguien que esté leyendo esto y no lo haya oído nombrar, al menos.

En cualquier caso, como generalmente conviene empezar con un contexto concreto, recordaré que el EIC es «la conexión, directa e indirecta, entre el sistema nervioso central y el conjunto de microbios (bacterias) que pueblan el tracto digestivo (microbiota) y que considera los efectos que la actividad de uno ejerce sobre el otro.»  ̶  Esto entre comillas y en cursiva no es una cita, es mi propia definición. Por tanto, podéis criticarla.

Numerosos trabajos demuestran la importancia de la microbiota en problemas como la obesidad 1, la diabetes 2, la colitis ulcerosa y el síndrome del intestino irritable 3 y muchas otras patologías asociadas al metabolismo energético y la alimentación. Sin embargo, hasta cierto punto esto es poco sorprendente. Al fin y al cabo, alimentación e intestino son conceptos intrínsecamente relacionados.

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(Imagen del The New Yorker. El pie de foto es propio)

Lo que levanta más curiosidad es saber que estudios preclínicos demuestran que esa misma flora bacteriana es crítica para el desarrollo del sistema nervioso central y ciertas conductas complejas 4. Así como que existe una relación directa entre la salud de la microbiota y la depresión 5, la ansiedad 6, o la esquizofrenia 7. Esta conexión entre las tripas y el cerebro no es tan intuitiva y mucha gente se sorprende (cuando no te miran con cara de que les estás vacilando). Sin embargo, a pesar de lo extraño que pueda parecer, resulta igualmente importante cuando se abordan cuestiones de salud en general y de salud mental en concreto.

A pesar de que este campo ha estallado recientemente, la cantidad de información acumulada es digna de mención. Así pues, hoy se sabe que los mecanismos fundamentales por los que se establece la conexión intestino-cerebro son especialmente dos: neuroendocrino y neuroinmune, a través de dos rutas de comunicación principales: el nervio vago y la circulación sistémica.

Pero bueno, hablar de microbiota en general es como no hablar de nada. No sólo porque existe una increíble variabilidad y variedad entre especies, géneros, cepas… sino porque parece que los números no son tan dramáticos como se ha comunicado. Los primeros estudios informaban de una relación de 10:1 entre células bacterianas y “humanas” (por cada célula humana, 10 microbios) 8. Y afirmaban que sólo las bacterias que se hayan en el tracto digestivo representan entre 1 y 1,5 kgs del peso corporal. Estudios más recientes 9,10 han demostrado que eso no es así; que la relación está más cerca del 1:1, o 1:2, y que el peso de las bacterias totales en el cuerpo es de 200 gr. aproximadamente, en una persona de 70 kgs.

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Distribución del número y peso de distintos tipos de células en el cuerpo (Fuente: Sender et al., 2013)

Pero esta cantidad es, como decía, increíblemente variada. No obstante, en lo que respecta a la microbiota intestinal, son tres los filos más importantes: Firmicutes (65% de la población), Bacteriodetes (23% de la población) y Actinobacteria (5% de la población); el 7% restante lo completan microbios de más de 127 géneros distintos. Aunque, de nuevo, esta relación puede cambiar no sólo en función de los hábitos de vida, sino en la misma persona con el paso del tiempo.

Cambios en la microbiota con el paso del tiempo (Fuente: Ottman et al., 2012)

Se ha demostrado que estos bichitos son capaces de alterar los niveles de neurotransmisores, bien mediante la producción directa o a través de la regulación de precursores. Resulta sorprendente que más del 90% de la serotonina del cuerpo se genera en el intestino. También que, por ejemplo, las Bifidobacterium infantis pueden elevar el nivel de triptófano (precursor de la serotonina) en plasma, lo que influye en niveles de serotonina a nivel cerebral 11.  Por su parte, otras como la Bifidobacterium spp. o algunas Lactobacillus pueden producir GABA, acetilcolina y dopamina 12. No está claro que estos neurotransmisores puedan cruzar la barrera hematoencefálica y alcanzar el cerebro, pero también existen receptores de estas moléculas en tejidos periféricos, con sus respectivas funciones.

Uno de los productos principales del metabolismo bacteriano son los ácidos grasos de cadena corta (SCFAs, por sus siglas en inglés). Estas moléculas (también de moda) están implicadas en la homeostasis y el metabolismo energético, y pueden modular las funciones del tejido adiposo, hepático y musculoesquelético 13.

La investigación del EIC es un campo de rápido crecimiento. Presenta importantes implicaciones para comprender cómo funcionan el cerebro y la conducta humanas.

Básicamente, la investigación se basa en manipular las bacterias del intestino para desvelar conexiones entre estas y la función cerebral normal (cognición, emoción, aprendizaje…) o patológica (ansiedad y depresión, autismo, adicción…).

Se han emitido múltiples afirmaciones acerca de la naturaleza causal de la relación entre la microbiota y la conducta humana. Desvelando estas relaciones, la investigación del EIC pretende aportar nuevas explicaciones sobre la salud mental, así como sobre potenciales vías de tratamiento.

Hasta ahora, no ha habido mucho examen a los métodos utilizados en este campo de investigación. Y cuando lo ha habido, se ha limitado principalmente a reiterar lo recogido en la vasta cantidad de revisiones sobre el tema. Esto ha propiciado un entorno en el que la mayoría de las personas, tanto académicas como no, ha aceptado de forma abierta y con ausencia de crítica los descubrimientos en este campo. Tanto los medios de comunicación globales como los medios especializados se centran en el potencial de la intervención dietética en la salud mental, asumiendo relaciones causales entre una y otra, cuando en la mayoría de las ocasiones no necesariamente se da el caso.

En su revisión «Microbiota-Gut-Brain research: a critical analysis», Hooks, Konsman y O’Malley abordan esta problemática y examinan, de forma crítica y rigurosa, los distintos métodos utilizados en las principales investigaciones sobre el EIC, así como la validez de los argumentos utilizados para concluir causalidad en las relaciones descubiertas en estos trabajos. Por ejemplo, estos autores llaman la atención acerca de que los neurotransmisores producidos por las bacterias en el intestino carecen de las características necesarias para ser designados como tales 14.

En concreto, estos autores se centraron en analizar dos categorías: (1) métodos de análisis de microbioma y (2) pruebas conductuales y estadística.

Con respecto al primer punto, los autores hacen hincapié en que la abundancia relativa y la diversidad de la microbiota puede variar de forma considerable entre personas. La dificultad que esto representa a la hora de interpretar diversas y complejas secuencias de datos hace que la inmensa mayoría de estudios sean de asociación. La correlación a estos niveles puede aportar información muy interesante, sobre todo a la hora de plantear hipótesis, pero no se puede establecer una causalidad entre la abundancia de determinada cepa y estados patológicos mediante este tipo de estudios.

Otra cuestión a tener en cuenta es que las muestras a partir de las que se estudia la microbiota en estos trabajos es materia fecal. Si ciertamente contiene microbios, es lícito cuestionar hasta qué punto representan la realidad de la flora intestinal.

De los 25 artículos más citados sobre el EIC se puede extraer cuatro grandes categorías de métodos de análisis.

  1. Comparación del comportamiento de roedores convencionales con el de roedores libres de gérmenes (Germ Free, GF) o libres de patógenos específicos (Specific Pathogen Free, SPF). Este método se utiliza en estudios en los que se realiza un transplante de microbiota de roedor convencional a uno GF o SPF y se observa si la conducta cambia 15.
  2. Estudios de roedores convencionales tratados con antibióticos. En estos estudios muchas veces se compara el comportamiento de ratones estándar antes y después de la administración de antibióticos. O entre dos grupos, uno con y uno sin antibióticos. También se utiliza este método para examinar la influencia de la recolonización posterior 16.
  3. Estudios en el que se administra proe/probióticos o placebo a la muestra (humanos o animales). Aquí, los más populares son los Bifidobacterium sp. y los Lactobacillus sp. No obstante, es importante mencionar que muchos de estos trabajos no son estudios de microbiota per se, dado que no incluyen un análisis posterior de esta.
  4. Estudios estándar de microbiota en que se evalúa las manipulaciones experimentales de la flora bacteriana. Muchos de los estudios de este tipo utilizan técnicas antiguas, lo cual limita todavía más la claridad de la interpretación de los datos.

A pesar de los avances en la tecnología de análisis, parece que la investigación en microbiota (y en concreto la investigación del EIC) continua con un claro problema de causalidad. Sin embargo, como otras veces se ha demostrado, «cuando el río suena, agua lleva». Y eso es independiente del hype del tema. No olvidemos que este campo es relativamente nuevo, por lo que no sólo hay que ser paciente con la tecnología, sino también con el desarrollo de conceptos, ideas y diseños capaces de contemplar la complejidad de la relación entre las bacterias intestinales y el cerebro.

Hasta aquí hoy. En la próxima entrega me centraré en el segundo punto mencionado antes: la conducta y la estadística.